中文名稱：猴外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞分離液試劑盒
中文別名：猴外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞分離液試劑盒
中文別名：猴外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞分離液試劑盒
產(chǎn)品類別：外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離
產(chǎn)品編號(hào)：VEHY2012MK
產(chǎn)品名稱：猴外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞分離液試劑盒
產(chǎn)品規(guī)格：2X200ml/Kit
產(chǎn)品價(jià)格：￥850.00元
本品用于分離猴外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞
“XXXX”動(dòng)物外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法
技術(shù)文檔編號(hào)：TBD0044SOP
【產(chǎn)品規(guī)格】
2×200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
| 名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 | |
| A | 分離液 1 | 200ml | |
| B | 分離液 2 | 200ml | |
| C | 清洗液（贈(zèng)品） | 2010X1118 | 200ml |
| D | 說明書 | 1 份 | |
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
適用儀器：最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
【檢驗(yàn)方法】
全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
方法一（需留取血漿備用）
- 首先取抗凝血 250g 離心 10min，棄血漿，補(bǔ)加胎牛血清（添加量與棄去血漿量等同）制成細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞懸液液體體積，選擇適當(dāng)離心管進(jìn)行試驗(yàn)。
- 取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2：1。如細(xì)胞懸液為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量最少不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。
- 用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上，500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到最佳分離效果）。
- 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色內(nèi)皮祖細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層 50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層。
- 用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品
- 250g，離心 10min。
- 棄上清。
- 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
- 250g，離心 10min。
- 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
分離圖例：
方法二（不需血漿留存?zhèn)溆茫?br />
- 根據(jù)新鮮抗凝全血樣本量選取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與抗凝血體積比為 2：1。如抗凝血為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量最低不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。
- 用吸管小心吸取抗凝血加于分離液液面上，500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到最佳分離效果）。
- 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為六層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色內(nèi)皮祖細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層。
- 后續(xù)步驟同方法一。
【差異貼壁法純化細(xì)胞】
（1）用內(nèi)皮祖細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：TBD20180012）或內(nèi)皮祖細(xì)胞完全培養(yǎng)
基（產(chǎn)品編號(hào)：TBD20180052）以 1.5-3×106 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次
性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。
（3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
注：
【注意事項(xiàng)】
【儲(chǔ)存條件及有效期】
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
基（產(chǎn)品編號(hào)：TBD20180052）以 1.5-3×106 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次
性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。
（3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
注：
- 無血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)篩選的胎牛血清。
- 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。
- 由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的，此法成本相對(duì)較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選。
【注意事項(xiàng)】
- 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
- 本實(shí)驗(yàn)最好不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
- 吸取過多的內(nèi)皮祖細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。
- 吸取過多的內(nèi)皮祖細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
- 分離液用量大于稀釋后的血液樣本時(shí)，分離效果更佳。
- 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助，具體聯(lián)系方式詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
| 本實(shí)驗(yàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞提取率大于 80%。 | ||||||||
| 下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。 | ||||||||
| 紅細(xì)胞 | 白細(xì)胞 | 血小板 | ||||||
| （4.0-10.0）×109 | ||||||||
| 含量（個(gè)/L） | （4.0-5.5）×1012 | 中性粒細(xì)胞 | 淋巴細(xì)胞 | 單核細(xì)胞 | （1.0-3.0）×1011 | |||
| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% | ||||||
| 【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】 | ||||||||
- 所獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
- 所獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
- 所獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)
D.PCR 技術(shù)
【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
| 出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
| 離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
| 離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長 | |
| 離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
| 離心后白環(huán)層太淺或看不見 | 細(xì)胞密度過小 | |
- 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
- 本分離液依照國際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到最佳分離效果，離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。
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