呋喃西林代謝物快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA 方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物呋喃西林代謝物將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗呋喃西林代謝物抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色， 樣本吸光值與其所含殘留物呋喃西林代謝物的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物呋喃西林代謝物的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度： 0.02ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min~15min
u 樣本檢測下限
組  織 ·······································   0.1ppb
雞  蛋 ·······································   0.1ppb

u 交叉反應率

呋喃西林代謝物 100%
呋喃唑酮代謝物 ＜0.1%
呋喃妥因代謝物 ＜0.1%
 

5	底物A 液	7ml	白色帽
6	底物B 液	7ml	黑色帽
7	終止液	7ml	黃色帽
8	20X 濃縮洗滌液	40ml	白色帽
9	2X 濃縮復溶液	50ml	透明帽
10	衍生化試劑	10ml	黑色帽

 

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋
微量移液器：單道 20~200μl、單道 100~1000μl、多道 30~300 μl
試 劑：氫氧化鈉、K₂HPO₄·3H₂O、正己烷、乙酸乙酯、濃 HCl

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知
（a） 實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b） 實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈， 必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

u 樣本前處理需配制

配液 1 0.1M K HPO 溶液：
2、 在 70℃水浴鍋中孵育 20min；
3、 分別加入 5ml 0.1M K₂HPO₄ 溶液，0.4ml 1M NaOH 溶液和 6ml 乙酸乙酯，充分振蕩 30s；
4、 在室溫下（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min
（如出現乳化現象或乙酸乙酯層不足   3ml        ，在80      ℃  水浴孵育樣品10min      并重復離心；或提高轉速和延長離心時間重復離心）；
5、 取出 3ml 的乙酸乙酯到另一個容器中于 50℃氮氣/空氣吹干。
6、 用 2ml 正己烷溶解干燥物，再加入 1ml 樣本復溶液充分混合 30s；在室溫下 4000r/min 以上離心    10min；去除上層正己烷相（如出現乳化現象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，       重復離心）；
7、 取 50μl 下層用于分析。
樣本稀釋倍數: 2 倍
此方法與呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、         呋喃妥因代謝物、氯霉素試劑盒可合一處理。

六、 酶標免疫分析程序:

u 測定前應須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫
（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。
3、 在ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定
個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標準品/樣品 50μl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物 50μl/孔，然后再加入抗體工作液 50μl/ 孔，用蓋板膜封板，25℃環境中反應 30min。
6、 將孔內液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250μl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 顯色：加入底物A 液 50μl/孔，再加入底物 B 液 50μl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色 15min。
8、 測定：加入終止液 50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內讀數），測定每孔 OD 值。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方
法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含呋喃西林代謝物量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為 0.3， 樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是： 0ppb 為 2.243；0.02ppb 為 1.816；0.06ppb 為 1.415；
0.18ppb 為 0.74；0.54ppb 為 0.313；1.62ppb 為 0.155。

2 4 程序中的要點。
則樣本 1 的濃度范圍是 0.54ppb～1.62ppb；樣本 2

呋喃它酮代謝物 ＜0.1%

u 樣本回收率

組  織 95%±25%
雞  蛋 95%±25%

三、試劑盒組成

稱 11.4g K₂HPO₄·3H₂O 加去離子水溶解定溶至 500ml。
配液 2 1M HCl 溶液：
取 8.6ml 濃HCl 加去離子水定容至 100ml。配液 3 1M NaOH 溶液：
稱 4g NaOH 加去離子水定容至 100ml
配液 4 樣本復溶液：
將 2X 濃縮復溶液用去離子水按 1：1 稀釋。

u 樣本處理

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 從 2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～
25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于 2-8℃。

的濃度范圍是 0.06ppb～0.18ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中呋喃西林代謝物實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即
B

 

肌肉組織、雞蛋樣本處理方法

3、 配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去
離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份
百分吸光率（%）＝
×100%
B₀

1、 稱取 1±0.05g 的均質物，分別加入 4ml 的蒸餾
水，0.5ml 1M HCl 溶液和 100μl 衍生化試劑， 充分振蕩 2min；
去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值B₀—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算