五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（a） 實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

（b） 實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

u 樣本前處理需配制：

配液1  樣本復(fù)溶液 

將20X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：19（1份濃縮復(fù)溶液+19份去離子水）進(jìn)行稀釋。

u 樣本處理：

a）組織樣本處理方法

1、稱1.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；

2、加入10ml樣本復(fù)溶液，振蕩3min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、取上清50μl液體用于分析。

     樣本稀釋倍數(shù)：10

b）血清樣本處理方法

1、 取50μl澄清的血清，加入450μl 樣本復(fù)溶液混合，混勻30S（如果血清樣本渾濁，將樣本于10℃，4000r/min以上離心10min，分離出血清或過濾血清，直至得到澄清的樣本）；

2、 取50μl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  10倍  

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

u 測(cè)定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。

3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均需做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔的樣本孔所在的位置。

5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50μl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

6、 用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 顯色：每孔加入底物A液50μl再加入底物B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

8、 測(cè)定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定吸光度值（OD值）。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含喹諾酮類藥物量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.845； 0.1ppb為1.542；0.3ppb為1.130； 0.9ppb為0.635；2.7ppb為0.326； 8.1ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb - 8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb - 0.9ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物的實(shí)際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

八、 注意事項(xiàng)

1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期

1、 儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)放心使用。


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